1525 году игуменом становится старец Иона, управлявший обителью 32 года в царствование государя Ивана Васильевича Грозного. Согласно записям монастырской  вкладной книги , при Ионе монастырю были пожалованы многие земельные вотчины, обитель понемногу благоукрашается, трудами настоятеля в монастыре были поставлены часы с самобоем, а на колокольне повешены новые колокола...

К этому же времени относится предание о столетнем старце Германе, дни и ночи проводившем в молитве и удостоенном дивного видения. Однажды ночью, выйдя из своей кельи, старец увидел на могиле преподобного Стефана горящий огонь, который озарял своим светом всю обитель. Изумленный старец поспешил разбудить игумена, а тот, собрав братию в церкви, совершил молебное пение святой Живоначальной Троице. Вскоре посетил обитель игумен Троице-Сергиева монастыря Арсений Сахарусов, его повелением над местом погребения преподобного Стефана была поставлена гробница, покрытая пеленой, а на ней большая свеча.

В 1557 году игумен монастыря становится Варлаам, будущий святитель Суздальский и Тарусский. С юных лет подвизаясь в святой обители, Варлаам имел огромную веру в молитвенное предстательство преподобного Стефана, а, став игуменом, не раз получал помощь в затруднительных обстоятельствах, с горячей молитвой обращаясь к преподобному. Будучи свидетелем многих чудесных исцелений, происходивших у гроба преподобного Стефана, игумен Варлаам с особым усердием собрал все сведения о жизни святого и преподнес свой труд митрополиту московскому Макарию. По благословению святителя иеромонах московского Данилова монастыря Иоасаф составил службу и житие преподобному Стефану, а царь Иван Васильевич Грозный пожертвовал средства на строительство каменного храма. При этом строительстве чудесным образом были обретены мощи святого. Когда был открыт гроб, поверх мощей обнаружили черный кожаный пояс с изображением двунадесятых праздников, подобный которому носили монахи Киево-Печерского монастыря. Пояс этот был вложен в серебряный крест, от которого многие стали получать исцеления.

Царь Иоанн IV (Грозный)	Святитель Макарий, митрополит Московский	Святитель Варлаам, епископ Суздальский

Над мощами прп. Стефана вскоре была сооружена каменная церковь (в честь преподобного), ставшая северным приделом нового Троицкого храма. Придел был освящен в 1558 году в присутствии самого государя Ивана Грозного и царицы Анастасии, пожертвовавшей облачения на престол, пелены к иконам и покров на раку преподобного. Сам царь неоднократно посещал Махрищскую обитель во время своих богомольных поездок, делая крупные денежные вклады и жалуя земли. Братии в эти годы в обители было более 60 человек. По благословению святителя Макария игумен Варлаам участвовал в восстановлении разоренной Авнежской пустыни, основанной некогда преподобным Стефаном и его учеником Григорием. Преподобномученики Григорий и Кассиан Авнежские были убиты при набеге вятчан и казанских татар в 1392 году. Память их совершается 15/28 июня.

В 1570 году игумен Варлаам был возведен в сан епископа Суздальского и Тарусского. Возглавляя Суздальскую кафедру, святитель много потрудился для прославления преподобной Евфросинии, княжны Суздальской, житие которой по промыслу Божию он нашел в книгохранилище Махрищского монастыря. Слава о преподобной княжне распространилась далеко за пределы древнего града, когда святитель представил все собранные материалы на суд Московского митрополита Антония. Стараниями святителя Варлаама святая Евфросиния была канонизирована в конце XVI века с почитанием ее памяти 25 сентября в день блаженной кончины преподобной.

После почти 15-летнего управления епархией святитель оставляет Суздальскую кафедру и возвращается на покой в Махрищский монастырь. Здесь он провел последние дни до своей праведной кончины, преставившись ко Господу 21 августа/3 сентября 1585 года. Покидая Суздальскую епархию, святитель Варлаам взял с собой Тихвинский образ Божией Матери, прославившийся затем в обители многими чудотворениями. Честное тело святителя погребли в каменной пристройке, примыкавшей к северо-западной стене Троицкого храма. Позднее при перестройке Троицкого собора при митрополите Московском Платоне могила святителя находилась в нижнем храме в особой палатке с северной стороны.

Ныне мощи святителя Варлаама, обретенные в 1998 году при раскопках, покоятся  в храме Пресвятой Троицы.

Во второй половине XVI века Махрищский монастырь становится крупным церковным землевладельцем. Вкладная книга монастыря упоминает многих именитых землевладельцев, пострадавших в годы опричной политики Ивана Грозного. Среди них – Кротковы, Клобуковы, Макаровы, Таратины, Обуховы, Баскаковы… Разоряясь, такие вотчинники жертвовали свои земли соседнему монастырю, некоторые из них вступали в его братство. Так, представители старинного рода вотчинников Кинельского стана сыновья Петра Зубова – Гавриил и Филипп (в иночестве – Герасим и Филофей) стали впоследствии старцами Махрищского монастыря, а в 1580 году, во время междуигуменства, управляли обителью.