В середине XVI века при игумене обители Варлааме, на пожертвования царя Иоанна Грозного, на месте сгоревшей деревянной Троицкой церкви было начато строительство каменного собора. При копании рвов для фундамента нового храма были обретены мощи первоначальника Махрищской обители преподобного Стефана. Над мощами решено  было возвести храм в честь преподобного, который и был воздвигнут в течение 1557-1558 годов. Эта церковь стала северным приделом еще строившегося в то время Троицкого собора.

В 1558 году придел был освящен в присутствии государя Иоанна Грозного и царицы Анастасии, пожертвовавшей облачения на престол, пелены к иконам и покров на раку преподобного.

Стефановский придел считался самостоятельным храмом, был  небольшого размера (около 12 метров в длину и 8 метров в ширину), прямоугольный в плане, с одним алтарным полукружием, увенчан световым барабаном и главкой с крестом. В северо-западном углу храма была устроена двухъярусная шатровая колокольня. У южной стены церкви, у алтарной преграды, напротив правого клироса, под спудом покоились святые мощи преподобного Стефана.

На протяжении XVII века русские цари и именитые бояре вносили в монастырь богатые вклады. На эти пожертвования благоукрашался и Стефановский храм.  

В 1807 году была разобрана обветшавшая Троицкая церковь, и на ее месте, по указанию митрополита Платона (Левшина), в 1808 году была возведена новая. После разборки Троицкой церкви придел преподобного Стефана стал отдельно стоящим храмом. К этому времени он состоял из прямоугольной в плане центральной части, к которой с востока примыкала полукруглая, смещенная к югу апсида, а к северо-западному углу – шатровая колокольня. Завершалась центральная часть небольшой главкой.

В начале 20-го столетия, по случаю предстоящего 500-летия со дня блаженной кончины преподобного Стефана, храм был значительно перестроен. Первоначально, еще в 1903 году, старую церковь предполагалось полностью разобрать, однако, Императорское Московское Археологическое общество под председательством  графини П.С. Уваровой выразило согласие лишь на частичную перестройку храма, причем с сохранением древней колокольни, как представляющей «археологический и художественный интерес».

В результате реконструкции, проводившейся по проекту архитектора И.Ф. Мейснера, была возвышена средняя часть храма с устройством свода и шатра, с перекладкою части существующих стен и подводкою местами нового фундамента, устроен новый алтарь взамен ветхого прежнего, с юго-запада вместо каменного сарая была сделана каменная пристройка со сводами для расширения храма. В самом храме был установлен новый дубовый иконостас, сделаны вновь престол и жертвенник, два клироса и киоты. Столярные работы производились известным александровским мастером Чистяковым, живописные – Ф.Д. Лавровским.

Освящение перестроенного храма совершил 5 июня 1906 года наместник Свято-Троицкой Сергиевой Лавры архимандрит Товия в сослужении Махрищского строителя Мелхиседека с братией.

В 1908 году ветхий деревянный пол был заменен каменным плиточным, были расписаны стены храма. Над гробом преподобного Стефана на средства жертвователей, насельников и рабочих Барановской фабрики села Карабаново, была устроена новая металлическая, вместо деревянной, сень.

В 1912 году при строителе иеромонахе Корнилии к храму преподобного Стефана, из-за его маловместимости,  была пристроена каменная паперть. Означенная перестройка не вызвала капитальной переделки самого храма и была выполнена сообразно с его архитектурой.

В 1923 году, монастырь был закрыт, храмы осквернены. В 1942 году Троицкий собор и Стефановская церковь были взорваны, щебень от построек использовался на сооружение аэродрома в деревне Слободка Киржачского района.

В конце 80-х начале 90-х годов на месте уничтоженного Троицкого собора и Стефановского храма находилась спортплощадка, крытая асфальтом, где под спудом почивали мощи святых угодников Божиих. Обитель  предстояло возрождать из руин. Спустя семьдесят лет после закрытия в 1993 году в монастыре появились первые насельницы, возобновились богослужения.

В 1995 году на просьбу сестер о помощи откликнулись благотворители, в монастыре начались восстановительные работы, но не было главной святыни: храма над мощами преподобного Стефана.

Летом 1996 года начались изыскательные и археологические работы по исследованию фундаментов Стефановского храма, на основании результатов этих исследований и сохранившихся в архиве чертежей архитектора Ивана Фелициановича Мейснера, автора  реконструкции храма 1904 – 1906 годов, был разработан современный проект восстановления Стефановской церкви. 

14 ноября 1996 года состоялась торжественная закладка первого камня. Храм рос буквально на глазах. Наиболее сложным этапом оказалась сборка шатра на земле, а затем подъем всей конструкции и установка ее на восьмерике. 14 ноября 1997 года, ровно через год после закладки первого камня, над храмом был поднят крест.

Здание было еще в лесах, еще шли штукатурные работы под куполом и в алтаре, еще не были настелены полы, а на конец ноября уже было назначено освящение храма.

25 ноября 1997 года, в день празднования иконы Божией Матери "Милостивая", Святейший Патриарх Московский и всея Руси Алексий II освятил престол во имя преподобного Стефана Махрищского. Впервые после стольких лет запустения  Предстоятелем Русской Православной церкви была принесена Бескровная Жертва над местом погребения Махрищского чудотворца. Престол был освящен, но работы в храме завершены еще не были.

Постепенно благоукрашался иконостас, в создании которого участвовали А.Лавданский, А.Соколов, А.Этенеер, С.Глоткин, М.Лавданский.  В канун праздника Пятидесятницы, 16 июня 2000 года, была установлена икона Святой Троицы и басменный Крест, увенчавший трехъярусный иконостас.

В 2006 году у западной стены воссоздана крытая паперть в том виде, в котором она была пристроена в 1912 году. 

К 600-летию со дня преставления преподобного Стефана, летом 2006 года, над местом упокоения первоначальника обители была установлена  рака с сенью, выполненная в технике басмы с элементами чеканки и литья. Автор работы Максим Лавданский. 

В 2007-2010 гг. художниками мастерской "Киноварь" и сестрами обители храм был украшен наружными росписями и изразцами.